सल्फानिलिक एसिड सोडियम नाइट्राइट के साथ प्रतिक्रिया करके डायज़ोटाइज्ड सल्फ़ानिलिक एसिड बनाता है। त्वरक (सीट्रिमाइड) की उपस्थिति में, संयुग्मित और असंयुग्मित बिलीरुबिन डायज़ोटाइज्ड सल्फ़ानिलिक एसिड के साथ प्रतिक्रिया करके एज़ोबिलीरुबिन (बिलीरुबिन टोटल) बनाता है। त्वरक की अनुपस्थिति में केवल संयुग्मित बिलीरुबिन ही प्रतिक्रिया करता है (बिलीरुबिन डायरेक्ट)। 546 एनएम पर अवशोषण की वृद्धि बिलीरुबिन एकाग्रता के समानुपाती होती है।

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