कोर्टिसोल एक एक-चरणीय इम्यूनोपरख है, जो प्रतिस्पर्धी पद्धति के सिद्धांत पर आधारित है। नमूने में मौजूद कोर्टिसोल और संयुग्म में लेबल एंजाइम-कोर्टिसोल एंटी-कोर्टिसोल लेपित माइक्रोप्लेट पर कैप्चर एंटीबॉडी से जुड़ने के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं। एंटीबॉडी-बाउंड अंश में एंजाइम गतिविधि मूल कोर्टिसोल एकाग्रता के व्युत्क्रमानुपाती होती है।
अनबाउंड घटकों को धोने से हटा दिया जाता है। टीएमबी और हाइड्रोजन पेरोक्साइड युक्त घोल मिलाने के बाद, बंधे हुए संयुग्म वाले कुओं में एक नीला रंग विकसित होता है, जो सल्फ्यूरिक एसिड के साथ प्रतिक्रिया बंद होने के बाद पीले रंग में बदल जाता है।
रंग की तीव्रता नमूने में देशी कोर्टिसोल की सांद्रता के व्युत्क्रमानुपाती है और इसे 450 एनएम पर पढ़ा जा सकता है।
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